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蛇類飲片的PCR鑒別方法
PCR為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡(jiǎn)稱，是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期,循環(huán)進(jìn)行,使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。
1 簡(jiǎn)述
1.1 本法適用于烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇飲片的PCR檢測(cè)。
1.2 本項(xiàng)鑒別的目的在于鑒別烏梢蛇、蘄蛇、金錢白花蛇飲片的真?zhèn)巍?/FONT>
2 儀器與用具
2.1 通用實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備。
2.2 PCR擴(kuò)增儀
2.3 電泳系統(tǒng)
2.4 凝膠成像系統(tǒng)或照相系統(tǒng)
2.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速達(dá)到10000rpm/min
2.6 重蒸餾水儀
2.7 液氮、研缽
3 試液與材料
3.1 DNA提取試劑盒：Promega 公司W(wǎng)izard SV Genomic DNA Purification System或上海生工生物工程有限公司UNIQ-10柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒。
3.2 蛋白酶K（Proteinase K）：Promega公司或其它同類產(chǎn)品。
3.3 PCR反應(yīng)試劑盒：包括Taq DNA聚合酶（5單位/μl）、四種脫氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液，10×PCR緩沖液（含25mmol/L Mg2+）。大連寶生物生物工程公司Takara Ex Taq或其它同類高保真DNA Taq 酶。
3.4 0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)溶液：將186.1g 二水乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na·2H2O），加入800ml水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0（約需氫氧化鈉20g），定容至1000ml。分裝后高壓蒸汽滅菌。
3.5 瓊脂糖：AgaroseI 上海生工生物工程有限公司（A0710）或其它同類產(chǎn)品。
3.6 電泳緩沖液：50×TAE緩沖液：稱取Tris堿242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至1000ml。使用時(shí)稀釋50倍使用。
3.7 GelRedTM核酸凝膠染色劑：Biotium 公司。GelRedä 是一種具有凝膠染色特性，并被設(shè)計(jì)為替換高毒性染色劑－溴化乙錠（EB）的紅色熒光核酸染色劑。
3.8 DNA分子量標(biāo)記（DNA Molecular Weight Marker）：DNA marker（100bpDNA ladder）上海生工生物工程有限公司或其他同類產(chǎn)品或其它同類產(chǎn)品。
3.9 加樣緩沖液：稱取溴酚藍(lán)250mg，加水10ml，在室溫下過(guò)夜溶解；再稱取二甲苯腈藍(lán)250mg，用10ml水溶解；稱取蔗糖50g，用30ml水溶解，合并三種溶液，用水定容至100ml，在4℃中保存。PCR反應(yīng)試劑盒中一般帶有該試劑。
3.10 引物
3.10.1金錢白花蛇引物：
5’GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3’
5’GGAATCTTATCGATATCTGATTAGTA3’
3.10.2蘄蛇引物：
5’GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT3’
5’CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC3’
3.10.3烏梢蛇引物：
5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’
5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’
3.10.4 引物溶液：引物由專業(yè)生物公司合成，純化方式為PAGE級(jí)。用無(wú)菌雙蒸水分別將上述引物稀釋到10μmol/L，開(kāi)蓋前10000rpm/min離心1min。
4 模板DNA提取
采用Promega Wizard SV Genomic DNAPurification System試劑盒。
4.1 取供試品適量（約0.5g），去除表面污染物，液氮中充分研磨使成粉末，取適量（約0.1g）至1.5mL離心管中；
4.2 加入275μl消化液，比例如下：
Nuclei lysis Solution 200μl
0.5M EDTA 50μl
Proteinase K（20mg/mL） 20μl
RNaseA Solution 5μl
總體積 275μl
① 放置55℃ 水浴中溫育1hr；
② 取出后加入250μL Wizard SV Lysis Buffer，混勻后將溶液全部轉(zhuǎn)移入過(guò)濾柱中，10000rpm離心3min；
③ 棄掉過(guò)濾液，加入800μl洗脫液，10000r/min離心1min；
④ 棄掉過(guò)濾液，反復(fù)清洗3次，每次10000r/min離心1min；
⑤ 棄掉最后一次過(guò)濾液后再離心2min，將過(guò)濾柱轉(zhuǎn)移入新的離心管中，加入100μl無(wú)菌雙蒸水，室溫放置2min后10000r/min離心2min。
⑥ 濾液-20℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>
5 PCR反應(yīng)與凝膠成像分析
5.1 配制PCR反應(yīng)體系
在冰上溶解10×PCR緩沖液、dNTP和引物，并配制下列反應(yīng)體系。其中Taq DNA聚合酶臨用時(shí)取出，避免反復(fù)凍溶。
在200μl PCR反應(yīng)管中依次加入：
10×PCR緩沖液 2.5μl
dNTP（2.5mM） 2μl
引物（10μM） 0.5μl
Taq DNA聚合酶（Takara公司，ExTaq 5U. μl-1） 0.2μl
模板（約100ng） 0.5μl
無(wú)菌雙蒸水 19.3μl
總體積 25μl
5.2 PCR反應(yīng)參數(shù)
以4000r/min離心10s后，將PCR管插入PCR儀中，進(jìn)行如下反應(yīng)：
烏梢蛇、蘄蛇：
95℃預(yù)變性 5min
95℃ 30s
63℃ 45s
72℃后延伸 5min
金錢白花蛇：
95℃ 預(yù)變性5min
95℃ 30s
55℃ 45s
72℃后延伸 5min
PCR反應(yīng)結(jié)果后，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)或在4℃保存。
5.3 對(duì)照PCR的選擇和建立
在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。
陽(yáng)性對(duì)照是指用經(jīng)過(guò)中國(guó)藥品生物制品檢定所鑒定的正品藥材提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板；陰性對(duì)照是指用相應(yīng)的偽品金錢白花蛇（赤練蛇），偽品烏梢蛇（灰鼠蛇）、偽品蘄蛇（眼鏡蛇）提取的DNA作為PCR反應(yīng)的模板；空白對(duì)照是指用無(wú)菌雙蒸水作為PCR反應(yīng)體系的DNA模板。上述對(duì)照PCR反應(yīng)體系中，除模板外其余組分與5.2相同。
5.4 電泳檢測(cè)
將適量的瓊脂糖加入1×TAE緩沖液中，加熱將其溶解，配制成瓊脂糖濃度為1.5%的溶液，然后按每100ml瓊脂糖溶液中加入10μl GelRedTM溶液的比例，加入GelRedTM溶液，混勻后將其倒入制膠器中，室溫下凝固成凝膠后，取出膠板，放入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中。在每個(gè)泳道中加入8μl的PCR產(chǎn)物（和2μl加樣緩沖液混合），其中一個(gè)泳道中加入DNA分子量標(biāo)記，接通電源按5V/cm恒壓進(jìn)行電泳20min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。
5.5 凝膠成像分析
電泳結(jié)束后，將涼脂糖凝膠置于凝膠成像儀上或紫外透射儀上成像。根據(jù)DNA分子量標(biāo)記判斷擴(kuò)增出的目的條帶的大小，將電泳結(jié)果形成電子文件存檔或用照相系統(tǒng)拍照。
6結(jié)果判斷
在陰性對(duì)照和空白未出現(xiàn)條帶，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶情況下，如試樣出現(xiàn)相應(yīng)大小擴(kuò)增帶則可判定該試樣為陽(yáng)性結(jié)果。
烏梢蛇：300～400之間（350bp）
蘄蛇：200～300之間（291bp）
金錢白花蛇：500～600bp之間（507bp）
如待測(cè)樣品未出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴(kuò)增條帶，則該樣品可判斷為偽品。 |
